Elisa要點：ELISA試驗洗板機(jī)洗板三個關(guān)鍵點

　　優(yōu)化ELISA的重點之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號，從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留，在最后一步產(chǎn)生信號。不充分的洗滌會導(dǎo)致差異和高背景，從而帶來不理想的結(jié)果。在做ELISA實驗時，洗板操作合乎要求，能得到正確、可靠的結(jié)果。

　　ELISA試驗過程中洗板機(jī)洗板人為因素少，速度快，條件恒定，但是使用洗板機(jī)洗板時應(yīng)注意以下三個關(guān)鍵點。

　　1、洗滌參數(shù)

　　主要的參數(shù)是洗滌量。自動洗板機(jī)會分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景，那么不要猶豫，將洗滌量調(diào)為高，最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同。

　　ELISA試劑盒的使用手冊中列出包被量。我們建議使用350µl洗滌液進(jìn)行洗滌，以便清潔整個反應(yīng)孔的壁。一般來說，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。

　　2、洗滌次數(shù)

　　影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量。當(dāng)然，洗滌次數(shù)越多，背景越低。然而，太多次的洗滌會降低信號強(qiáng)度，使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次。不過，一般而言，包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對于用戶包被的ELISA板，必須優(yōu)化洗滌次數(shù)。

　　控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說，96孔板的每個孔能容納330至460 µl。不過，有些自動化洗板機(jī)可設(shè)置程序，分配遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出這個量的洗滌液，比如1 ml。它是如何做到的呢?其實很簡單，就是在分液的同時打開吸液功能。換句話說，隨著分液器分配更多的液體，抽吸器也將液體吸出。這種技術(shù)能增加洗滌量，但不會溢出到其他孔中。

　　3、抽 吸

　　還有一些參數(shù)會影響洗滌步驟的效果。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調(diào)整，以降低背景(殘留量)和差異。

　　殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體，它們會增加背景信號。殘留量越小，殘留液體越少，轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少。

　　吸液高度會明顯影響殘留量;如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大，那就會讓殘留量急劇增加。反之，如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部，那么也會使吸液效率降低，殘留量增加。

　　目前的洗板機(jī)一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動，而剛性洗頭則固定在適當(dāng)?shù)奈恢?。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來更為復(fù)雜，因為你需要非常仔細(xì)地調(diào)整吸液高度。如果你們實驗室使用幾種不同的板，那可能會很耗時。在使用浮動洗頭時，吸頭會降到反應(yīng)孔的底部。調(diào)整高度就不是很重要，因此洗頭會下降到底部。

　　抽吸的位置也對殘留量有著重要影響;如果每個孔只使用一個抽吸點(這很常見，因為更快)，那么抽吸的位置需要優(yōu)化。最佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間，即使這是所有洗頭最常見的默認(rèn)位置。一般來說，最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。

　　反應(yīng)孔的形狀也會影響殘留量。C形底(平底圓角)的微孔板一般會比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。

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